L'organisation sociale des abeilles conduit à une forte proximité et de nombreuses interactions entre les individus d'une ruche. Les risques de transmission et de développement d'infection sont donc importants. Au cours de l'évolution, alors que les mécanismes de l'immunité individuelle n'ont pas tous été conservés, une immunité sociale s'est développée chez les abeilles.

 

Cette coopération entre les membres d'une colonie permet de limiter le risque élevé de transmission des parasites chez les organismes sociaux. Face aux enjeux de conservation de l'abeille, la compréhension et l'identification de ces mécanismes de défense est cruciale pour l'apiculteur.

 

Rothenbuhler remarque que les abeilles sont capables de reconnaître et de nettoyer du couvain malade. En 1964, il nomme ce comportement le comportement hygiénique (Hygienic behaviour). Ne pouvant pas présenter tous les mécanismes de défense des abeilles contre les parasites, nous nous limiterons à l'étude de ce comportement.

Dans un premier temps nous présenterons les modalités du comportement hygiénique. Nous finirons par étudier les différentes méthodes permettant de déterminer sa présence dans les colonies.

 


  Sommaire:

1. Modalités du comportement hygiénique

1.1 Signification d'abeilles hygiéniques

1.2 Les avantages apicoles du comportement hygiénique

1.3 Particularités des abeilles hygiéniques

1.4 Origine génétique du comportement hygiénique

1.5 Effet de l'environnement sur le comportement

hygiénique

2. Évaluation du comportement hygiénique dans nos ruchers (test hygiénique)

2.1 Test hygiénique à l'aiguille

2.2 Test hygiénique au couvain congelé

2.3. Le test au chalumeau

2.4. Le test à la bombe de froid

2.5 Types de tests et variations des résultat

Conclusion

Bibliographie 

 


1. Modalités du comportement hygiénique

Afin d'éviter des erreurs d'interprétation lors de son identification sur le terrain, nous commencerons par étudier le comportement hygiénique dans sa globalité. Nous vous présenterons les limites actuelles des connaissances sur le sujet.

1.1 Signification d'abeilles hygiéniques

 

Modalité.png

Panasiuk présente en 2009 un article où il tue du couvain en le congelant 12h à -18°C. Il remarque que les abeilles sont capable de le nettoyer.

Ses observations amènent à découper le comportement hygiénique en plusieurs étapes :

- reconnaissance du couvain malade

- désoperculation

- nettoyage de la cellule : il s'agit de l'étape la plus longue.

Les abeilles ayant un comportement hygiénique sont capables de nettoyer du couvain mort. Quel est l'intérêt de ce comportement?

1.2 Les avantages apicoles du comportement hygiénique

loque.png

Spivak en 2001 publie un article présentant l'effet du comportement hygiénique sur les loques.

La table I présente le nombre de colonies avec des signes cliniques de loque après inoculation ou sans inoculation. Nous pouvons observer que le 21 août 1998, 9/9 colonies non hygiéniques ont des signes cliniques alors que 0/8 colonies hygiéniques ont des signes cliniques de loque. Le nombre de colonies ayant des signes cliniques de loque est toujours inférieur chez les colonies hygiéniques à celui des colonies non hygiéniques. Nous pouvons conclure que les colonies hygiéniques sont donc moins sensibles aux loques.

 

non_traitées.pngvarroa_non_traitees.png

 

Les deux graphiques ci-dessus (Spivak 2001) présentent le pourcentage de couvain infecté et le nombre de varroas pour 100 abeilles sur différents ruchers. Il y a des abeilles hygiéniques et d'autres non hygiéniques (starline). Nous pouvons voir que le nombre de varroas par abeille entre les colonies hygiéniques et starline n'est pas toujours significativement différent, tout particulièrement lors de fortes infestations. Mis à part dans les fortes infestations, le couvain est moins infecté chez les colonies hygiéniques. On peut se demander comment se met en place cette résistance.

varroa.png

Le graphique ci-dessus vient du travail du Dr Spivak en 1996. Il présente le pourcentage de pupes nettoyées par des abeilles après l'infection par un varroa ainsi que le succès reproducteur des varroas. L’expérience se déroule dans une Jenter Box. On observe qu'environ 70% des varroas sont éliminés chez les colonies hygiéniques alors que seulement 10% sont éliminés chez les colonies non hygiéniques. Les colonies hygiéniques éliminent plus de varroa dans le couvain. Par ailleurs, le succès reproducteur des varroas est de 7.3% pour les colonies hygiéniques et de 37% pour les colonies non hygiéniques. Les colonies hygiéniques conduisent à une baisse du succès reproducteur des varroas. D'autres études sont nécessaires pour expliquer les mécanismes biologiques impliquées. 

 

Corrélation hygiénique et varroa

 La Fig. 1 des données des travaux de Toufailia en 2014 présente en ordonnée la croissance des varroas entre un test phorétique en janvier après un traitement à l'acide oxalique (0.55% ± 0.34) et un nouveau test en décembre, en abscisse est représenté le niveau de nettoyage de couvain congelé après 24h. On peut voir une corrélation négative entre le niveau de nettoyage et l'augmentation des varroas (courbe en pointillée). Cette corrélation est entièrement du aux colonies très hygiénique car si on enlève les colonies très hygiénique (>95%), on observe pas de corrélation. 

DWV et varroa

La deuxième figure présente en ordonnée la quantité de virus DWV et en abscisse le niveau de couvain congelé nettoyé en 24h. On peut observer une corrélation négative entre la présence de virus et le niveau du caractère hygiénique avec (courbe pleine) ou sans les colonies les plus hygiéniques (courbe en pointillé). Ces travaux montrent que chez les colonies des colonies plus ou moins hygiénique 

Cette partie nous a permis de comprendre que le comportement hygiénique est un caractère qu'il faut prendre en compte pour évaluer la résistance de nos colonies. Nous pouvons nous demander quelles sont les particularités des abeilles hygiéniques.

1.3 Particularités des abeilles hygiéniques

 

age.png

Le document ci-dessus provient de l'étude de Panasiuk de 2010. Il présente le nombre de visites impliquées dans le comportement hygiénique en fonction de l'âge des abeilles. On observe qu'à tout âge les jeunes abeilles sont impliquées dans le comportement hygiénique, mais que les abeilles de 6 jours ont une activité hygiénique plus importante.

proboscis.png



En 1999, le Dr Masterman en 1999 a étudié les réflexes conditionnés des abeilles hygiéniques ou non hygiéniques vis à vis du géraniol ou du convain. Le réflexe conditionné le plus connu est celui de sécrétion de salive par les chiens lorsqu'ils entendent le bruit de la porte du placard contenant leurs croquettes.

Dans son expérience, il mélange une molécule odorante, soit avec une solution sucrée (conditionnement positif : CS+), soit avec une solution salée (conditionnement négatif : CS-). Il ne mesure pas la quantité de salive produite comme chez le chien mais l'extension du proboscis des abeilles à chaque essai.


Les parties A et B du document nous montrent que les abeilles apprennent que les solutions de géraniol (doc A) ou de geraniol (doc B) sont associées au CS+. Les abeilles sont capables de discriminer les deux odeurs de fleurs, mais les études statistiques ont montré qu'il n'y avait pas de différences significatives entre les lignées hygiéniques et non hygiéniques.


Les parties B et C montrent la probabilité de réponse conditionnelle en fonction de l'odeur du couvain. On peut observer que les colonies hygiéniques ont un pattern de réponse typique d'une discrimination conditionnée. Elles repèrent rapidement l'odeur associée à la solution sucrée. Sur la partie D on peut voir que la réponse des colonies au CS- diminue alors que les colonies non hygiéniques maintiennent une réponse significativement élevée au CS- par rapport aux colonies hygiéniques.

On peut conclure que les colonies hygiéniques et non hygiéniques sont capables de reconnaitre les odeurs des fleurs de la même façon. Il est possible qu'une différence significative aurait pu être trouvée avec un dosage des molécules odorantes plus faible. Concernant la discrimination du couvain, les abeilles hygiéniques discriminent mieux les paires d'odeurs par rapport aux abeilles non hygiéniques. Le comportement hygiénique est donc dû à une meilleure discrimination des odeurs du couvain.


Swanson en 2009 a cherché à comprendre quelles étaient les molécules détectées par les abeilles hygiéniques lorsque le couvain est infecté. Il a révélé 3 composants volatiles collectés sur des larves infectées par Ascosphaera apis, détectés par des abeilles adultes, et absents sur des larves en bonne santé. Il s'agit du phenethyl acetate, du 2-phenylethanol et du benzyl alcohol. Des essais ont montré que le phenethyl acetate est associé au comportement hygiénique.

 

octopanine.pngoctopanine_négatif.png

Le Dr. Spivak publie en 2002 une étude sur l'octopamine, car ce neuromédiateur joue un rôle important sur les comportements liés à l'olfaction. On retrouve ce neuromédiateur dans le deutocérébron et la partie médiane des lobes anténaires de manière plus importante chez les abeilles hygiéniques. Les documents ci-dessus présentent l'électroanténogramme d'abeille en réponse à 3 concentrations de couvain malade. Il y a comme groupes d'étude : des abeilles hygiéniques et non hygiéniques nourries avec de l'eau ou de l'octopamine ou de epinastine (antagoniste de l'octopamine). On peut voir sur la première partie du document que les abeilles Hyg-OA, NonHyg-OA et Hyg ont une activité plus importante que les abeilles NonHyg pour les faibles concentrations de couvain malade. On observe sur la deuxième partie du document que les abeilles hygiéniques ont une activité plus importante que les abeilles NonHyg, NonHyg-Epin et Hyg-Epin. On peut donc déduire que l'abondance d'octopamine facilite la détection du couvain malade chez les abeilles hygiéniques.

 

1.4 Origine génétique du comportement hygiénique

En 1964 Rothenbuhler, étudie déjà la génétique du comportement hygiénique. Pour cela, il utilise deux lignées pures (homozygotes): des abeilles hygiéniques qui désoperculent [D+] et nettoient [N+] le couvain infecté et des colonies qui ne désoperculent pas [D-] et ne nettoient pas [D-] le couvain (non hygiéniques).

 

Générations CroisementsPhénotype et génotype des générations
F0En lignée pure

 

1 lignée pure hygiénique100%

 [D+ N+]

d//d n//n

 

1 lignée pure non hygiénique100%

 [D- N-]

D//D N//N

F1F0 [D+ N+] X F0 [D- N-]100% [D- N-]D//d N//n
F2

 

Back cross

F1[D- N-]*F0 [D+ N+]

 

25%

[D+ N-]

d//d N//n

 

25%

[D+ N+]

d//d n//n

 

25%

[D- N-]

D//d N//n

 

25%

[D- N+]

D//d n//n

 

 

Le tableau ci-dessus présente les résultats des croisements qu'il effectue. En croisant des abeilles hygiéniques [D+ N+] avec des abeilles non hygiéniques [D- N-], il obtient en F1 des colonies non-hygiéniques [D- N-]. On peut donc conclure que le caractère hygiénique est associé à des allèles récessifs par rapport aux allèles du caractère non hygiénique.

En recroisant des mâles de F1 avec des reines de la lignée hygiénique (back-cross), Rothenbühler obtient 4 types de colonies: des colonies hygiéniques [D+ N+], des colonies non hygiéniques [D- N-], des colonies qui ne font que désoperculer [D+ N-] et des colonies qui nettoient si l'on désopercule [D- N+]. On peut conclure (en vert dans le tableau l'interprétation du génotype) que le comportement hygiénique est au moins porté par 2 gènes et le phénotype de ses allèles est récessif par rapport au phénotypiques des allèles déterminant le comportement non hygiénique.

L'article publié par Oxlay en 2010 sur les "quantitative trait loci" basée sur des séquences "microsatellites". Il a montré que 3 loci sont impliqués dans 30% des variations phénotypiques qui ont une probabilité d'engager le comportement hygiénique: deux loci dans la désoperculation et 1 locus dans l’enlèvement de la larve malade. Les gènes candidats au comportement hygiénique seraient des gènes de l'olfaction, de l'apprentissage, des comportements sociaux et un gène lié à la locomotion circadienne. Cette étude ouvre les bases d'une sélection basée sur des marqueurs génétiques.

effet_maternel.png

 L'étude de Unger et Guzman Nova plubliée en 2009 cherche à comprendre si le comportement hygiénique répond à une génétique purement mendélienne ou s'il était aussi lié à un marquage de l'ADN (méthylation...). Les deux graphiques présentent l'importance du comportement hygiénique (A : désoperculation et B extraction des larves) chez des lignées russes (hygiénique) et d'ontario (non hygiénique) et chez des colonies provenant du croisement de reines russes (RQ) avec des mâles d'ontario (OD) et inversement. Sur le premier graphique, on peut voir que les croisements faits avec une reine russe conduisent à une désoperculation plus importante que lorsque les croisements utilisent des reines non hygiéniques (ontario).

On peut donc conclure qu'il existe une empreinte maternelle (marquage de l'ADN) intervenant sur l'expression des gènes permettant la désoperculation du couvain malade.

 

1.5 Effet de l'environnement sur le comportement hygiénique

taille_pop.png

La publication Njafgholian J. en 2011 cherche à comprendre l'impact de la taille de la colonie sur le comportement hygiénique. Le graphique ci-dessus présente le pourcentage de cellules nettoyées 48h après congélation à l'azote liquide en fonction de la taille de la colonie exprimée en nombre de cadres d'abeilles. On peut voir que plus la colonie à une taille importante, plus le comportement de nettoyage est rapide.

 saison.png


Le graphique (Panasiuk 2009) ci-dessus présente le pourcentage de cellules nettoyées en fonction du temps (en heures). Les différents mois sont représentés par des bâtons de couleurs différentes. On observe que le mois de Juillet est le mois où les colonies ont le comportement hygiénique le plus lent. Cette étude a aussi mis en évidence que seule l'entrée de nectar le jour avant le test hygiénique à un impact positif significatif sur le comportement hygiénique.

DWV.png
Schöning et  son équipe ont étudié le comportement hygiénique de colonies infectées par des varroa très infectés par le DWV .  Ce virus transmis par les varroa, peut être létal une fois transmis aux pupes. Les symptômes sont un raccourcissement et un gonflement de l'abdomen ainsi que les ailes déformées chez les adultes. La charge virale de la colonie a donc un impact sur le comportement de comportement hygiénique.

vieux-cadre.png

Le document suivant provient de l'étude de Pereira réalisé en 2013 sur des abeilles africaines. Le test hygiénique a été effectué avec des aiguilles. Nous pouvons vous que les courbes sont croissantes et monotones. Les courbes en trait plein présente les cellules nettoyées sur des cadres neufs et les pointillés présentent le comportement sur des vieux cadres. Les courbes bleue et rouge sont réalisées sur des abeilles hygiéniques et les courbes verte et violette sont réalisées sur des abeilles non hygiéniques. On peut voir que l'age du cadre impact la vitesse de nettoyage avant 24h. Cette différence n'apparaît pas ensuite.

nuit-jours.png

Dans la même étude, on retrouve ce tableau qui nous indique le temps médian passé pour nettoyé le couvain mort. Nous pouvons voir que les abeilles passe plus de temps à nettoyer le couvain la journée mais que cette valeur est différentes de la nuit que si les cadres sont neufs. On peut donc conclure que le cycle jours nuits influence légèrement la rapidité du nettoyage. Il est donc plus sérieux de ne pas faire des test hygiénique sur moins de 24h.

2. Évaluation du comportement hygiénique dans nos ruchers (test hygiénique)


Nous avons vu que la taille de population et la miellée peuvent influencer ce caractère. Le test doit donc être fait hors miellée. Il n'est possible de comparer ce comportement que chez des colonies de même taille. Dans chaque test une centaine de larves sont tuées de différentes manières. On observe ensuite au bout de 24h le pourcentage de couvain nettoyé. Il faut prendre des photos des zones de couvain étudiées au temps 0, 24h (voir photos). Les horaires correspondant aux photographies doivent être visibles. Pour compter les cellules nettoyées, je vous invite à utiliser la fonction "comptage" du logiciel gratuit "Mesurim".

Nous allons vous présenter maintenant les différentes techniques permettant de mettre en évidence le comportement hygiénique.

 

2.1 Test hygiénique à l'aiguille

bcc4788299.jpg

Le test à l'aiguille consiste à piquer des nymphes de cellules de couvain operculé mais non naissant. Les aiguilles utilisées pour percer les cellules doivent être les plus fines possibles (N°000). Pour gagner du temps, l'utilisation d'un gabarit est intéressant (voir photo AGT). Une aiguille est placée sur la première cellule, une autre sur la dernière et une troisième sur la 51ème cellule operculée. Il faudra prendre les photos avec le gabarit en place. Pour repérer rapidement le cadre que vous avez utilisé, il est judicieux de mettre une punaise sur le haut du cadre.



2.2 Test hygiénique au couvain congelé

2008%2B08%2B024b.JPGIl est possible de congeler la zone de couvain operculé avec de l'azote liquide en utilisant une boite de conserve découpée. Le problème de cette technique est le stockage de l'azote liquide sur l'exploitation. Par ailleurs, le temps l'azote s'évapore et que le cadre revient à température ambiante, les cadres sont exposés au pillage dans le rucher. 

Le plus simple consiste à découper au cutter une zone de couvain de 10X10 cellules (voir photo). Chaque échantillon est mis dans un sac congélation et étiqueté du nom de la ruche et du rucher. Le couvain doit ensuite être mis au congélateur à -18°C entre 12h (Panatela 2010) et 24h (Spivak 2001). Le morceau de couvain doit ensuite être remis dans sa colonie et pris en photo. Il est mieux de laisser revenir les morceaux de couvain à température ambiante avant de les mettre dans la ruche.

 

2.3. Le test au chalumeau

Pour plus de rapidité, certains pratiquent le test au chalumeau. En effet, il n'est nécessaire d'ouvrir la ruche que 2 fois avec cette technique contre trois avec le couvain congelé:

1. Brûler une zone de couvain limitée par une boite de conserve sans fond et prendre une photo.

2. 24h après, prendre une nouvelle photo.

Les colonies qui nettoient en 24h le couvain congelé ont aussi nettoyé le couvain brûlé avec le chalumeau. Lors de l'exposition à la chaleur, la cire fond et ouvre les cellules. Même s'il n'y a pas de littérature sur le sujet, je pense que cette technique permet de déterminer le comportement de nettoyage mais pas forcément la capacité de sentir les larves en mauvaise santé à travers l'opercule.

2.4 Le test à la bombe de froid

La détente d'un gaz conduit à un abaissement de la température. Ce principe, permet de faire rapidement son test HYG en aspergent pendant 20s un morceau de couvain operculé. Pour bien délimiter la zone de froid, il faut utiliser un cylindre (boite de conserve sans fond) que l'on place sur le couvain.  Il faut faire attention de ne pas acheter des bombes mentholées. La photo du couvain doit être prise 24h plus tard pour voir la désoperculation.

 On peut se demander si toutes les techniques présentées pour évaluer le comportement hygiénique sont équivalentes.

2.5 Types de tests et variations des résultats

variation du test hygiénique suivant la technique utilisée

 

La publication du Dr Panisuk en 2008 met la lumière sur les différence entre chaque méthode. Le graphique suivant présente le pourcentage de cellules nettoyées en fonction de la méthode utilisée pour tuer le couvain. On voit que la technique à l'aiguille conduit à un nettoyage plus rapide des cellules. Cela s’explique par la présence de trous dans les opercules de couvain qui laissent passer les odeurs de couvain mort plus facilement. La technique du couvain congelé conduit à un nettoyage plus lent du couvain. Pour cette raison, la technique du couvain congelé est plus intéressante car elle permet une meilleure discrimination entre les colonies. Ces observations nous permettent de comprendre qu'un résultat de test hygiénique n'est intéressant que si l'on connait la technique utilisée.

 

Conclusion:

Nous avons vu que le comportement hygiénique est un mécanisme d'immunité sociale des abeilles. Ce phénotype est déterminé génétiquement mais aussi par l'environnement. Ce caractère est facile à identifier dans les colonies. C'est pour cela que les tests hygiéniques doivent être présents dans tous les travaux de sélection sur l'abeille. Des sélections ne reposant que sur les caractères de production ne permettront pas à l'apiculture de se maintenir.

  

Bibliographie:

Cremer S. et al. (2007)- Social immunity; Current Biology

Gramacho K. P. et Spivak M. (2003)- Differences in olfactory sensitivity and behavioral responses among honey bees bred for hygienic behavior; Behav Ecol Sociobiol

Masterman R. Smith B. H and Spivak M(2000) - Brood Odor Discrimination Abilities in Hygienic Honey Bees (Apis mellifera L.) Using Proboscis Extension Reflex Conditioning; Journal of Insect Behavior

Najafgholian J. (2011)- Effect of population size on the expression of hygienic behavior in the Iranian honey bee (Apis. mellifera meda); Asian journal of biotechnology ressources

Oxley P.R. ,Spivak M. et Oldroyd B. P. (2010)- Hygienic behaviour in honeybees (Apis mellifera) Six quantitative trait loci influence task thresholds for hygienic behaviour in honeybees (Apis mellifera), Moléecular Ecology

Panasiuk B. et al (2010)- Age of workers bees performing hygienic behaviour in a honeybee colony
Panasiuk B. (2009)- Effect of périod of season and environmental conditions on rate of cleaning cells with dead brood; Journal of Apicultural Science

Panasiuk B. (2008)- Influence of genotype and methode of brood killing on brood removal rate in honey bee; Journal of Apicultural Science

Rothenbuhler W. (1964)- Behavior genetics of nest cleaning in honey bees. IV. Responses of F1 and backcross generations to disease-killed brood; American Zoologist

Rogério A. Pereira et al. (2013) - Hygienic Behavior of Africanized Honey Bees Apis mellifera directed towards Brood in Old and New Combs during Diurnal and Nocturnal Periods

Spivak M et Al (2002)- Hygienic Behavior in the Honey Bee (Apis mellifera L.) and the Modulatory Role of Octopamine

Spivak M. (2001)- Resistance to American foulbrood disease by honey bee colonies Apis mellifera bred for hygienic behavior; Apidologie

Spivak M. (1996)- Honey bee hygienic behavior and defense against Varroa jacobsoni; Apidologie

Spivak M. et Reuter G.S. (2001)- Varroa destructor Infestation in Untreated Honey Bee (Hymenoptera: Apidae) Colonies Selected for Hygienic Behavior; J. Econ. Entomol.

Toufalia (2014) - Towards integrated control of varroa: effect of variation in hygienic behaviour among honey bee colonies on mite population increase and deformed wing virus incidence

 

Unger P. et Guzman Novoa E. (2009)- Maternal Effects on the Hygienic Behavior of Russian 3 Ontario Hybrid Honeybees (Apis mellifera L.); Journal of Heredity

Wanson J. et al (2009)- ODorants that Induce Hygienic Behavior in Honeybees: Identification of Volatile Compounds in Chalkbrood-Infected Honeybee Larvae; Journal of chemical ecology